自血穴位注射疗法对哮喘患者

IL-4、IL-5、IL-10mRNA表达的影响

[摘要]  目的  探讨自血穴位注射疗法治疗哮喘的分子机制。  方法  采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，半定量测定自血穴位注射疗法治疗前后哮喘患者外周血单个核细胞（PBMC）中IL-4、IL-5、IL-10mRNA的表达情况。 结果  急性期时哮喘患者PBMC中IL-4mRNA与IL-5mRNA表达均增强，经自血穴位疗法治疗后，其表达同时显著降低；IL-10mRNA经自血穴位疗法治疗后表达显著升高。      结论  自血穴位注射疗法通过在基因转录水平抑制IL-4、IL-5的表达，增强IL-10的表达而发挥其对哮喘的治疗作用。

[关键词]  哮喘  自血疗法  白细胞介素-4  白细胞介素-5  白细胞介素-10 

   支气管哮喘是一种由多种细胞因子和炎性介质参与的气道慢性炎症性疾病，本试验通过研究自血穴位注射疗法对哮喘患者治疗前后外周血单个核细胞（PBMCs） IL-4mRNA、IL-5 mRNA、IL-10 mRNA表达的影响，探讨其对哮喘基因表达及调控的影响，力图从基因表达水平阐明自血穴位注射疗法对哮喘作用的分子机制，为穴位注射疗法治疗疾病提供科学依据。

材料和方法

1、    主要试剂：总RNA提取试剂盒为GENTRA公司的RNA Isolation Kit；RT-PCR试剂盒为INVITROGEN公司产品。

2、    引物的设计与合成：引物由上海申能博彩生物科技有限公司设计合成。

    IL-4（375bp）

    上游：5’-CTT CCC CCT CTG TTC TTC CTG CTA-3’

下游：5’ CGT ACT CTG GTT GGC TTC CTT CAC 3’

IL-5（239bp）

上游：5’-ACC TTG GCA CTG CTT TCT ACT CA-3’

下游：5’-ACT CTC CGT CTT TCT TCT CCA CAC-3’

IL-10（309bp）

上游：5’-CTG CTC TGT TGC CTG GTC CTC CTG-3’

下游：5’-ATG CGC CTT GAT GTC TGG GTC TTG-3’

3、    主要仪器： 3K18高速冷冻离心机（Sigma），LABOR-220电子天平（岛津），Mini电泳系统（Bio-rad），Spec 3000紫外/可见光分光度计（Amersham），Multi Genius凝胶成像系统（Syngene），2400PCR仪（PE）。

4、    实验方法与步骤

4.1  标本采集    根据中华医学会制定的哮喘诊断标准，于哮喘患者急性发作期和治疗缓解期分别肘静脉采血1ml，放入冻存管，置液氮中保存。

4.2  总RNA提取及纯度检测    用GENTRA公司的RNA Isolation Kit提取总RNA，放-80℃冰箱保存。1.5%琼脂糖电泳检测其完整性。用紫外分光光度计测定样品在260nm/280nm比值及浓度。

4.3  RT：取总RNA1ug，加50uM Oligo(dT)₂₀1ul，10mM dNTP混合物2ul，加灭菌水至总体积为12ul，小心混匀后于PCR仪上65℃孵育5分钟，取出后立即置于冰上。依次加入下列试剂：5倍RT 缓冲液4ul、0.1M DTT1ul、 RNA酶抑制剂1ul、DEPC处理水1ul、ThermoScrip^TM逆转录酶1ul，小心混匀后于PCR仪上55℃孵育30分钟、85℃5分钟，冰上冷却，立即PCR或置于-20℃保存。

PCR：各样品取RT产物2ul再依次加入下列试剂：10倍PCR缓冲液5ul、50mM MgCL₂1.5ul、10mM dNTP混合物1ul、10uM上游引物1ul、10uM下游引物1ul、Platimun Taq酶0.4ul(2U)、灭菌水38.1ul，总体积为50ul，混匀后进行PCR扩增。反应条件为：IL-4、IL-10为94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环； IL-5、β-actin为94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。

4.4  电泳：各取PCR扩增产物10ul，加6×加样缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE,100伏恒压电泳1.5小时，经0.5ug/ml的溴乙淀（EB）染色10分钟，于凝胶成像系统中照像。并用凝胶成像系统自带分析软件分析，获得每一标本的各白细胞介素与内参β-actin PCR扩增产物的光密度比值，确定IL-4、IL-5和IL-10的mRNA表达半定量值。

4.5  统计学处理：采用t检验。

结   果

一、总RNA 纯度鉴定

260mm/280mm比值为1.8~2.0，琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S两条带清晰，且

前者的荧光强度约为后者的2倍，无其它大分子条带，表明总RNA无蛋白质污染，无降解。

（补充图为）

二、IL-4mRNA表达的变化

  M     1前   1后   2前   2后  3前  3后   4前   4后   5前   5后   6前   6后   7前  7后   8前    8后  M

三、IL-5mRNA表达的变化

M     1前   1后   2前   2后  3前  3后   4前   4后   5前   5后   6前   6后   7前  7后   8前    8后  M

四、IL-10mRNA表达的变化

M    1前   1后   2前   2后  3前  3后   4前   4后   5前   5后   6前   6后   7前  7后   8前    8后  M

实验结果讨论：

RT-PCR法以其灵敏、快速、简便、所需RNA量少等特点而广泛应用于基因mRNA表达的检测。

由实验图谱我们可以看出，总体而言：哮喘病人经自血疗法后，其白介素4、5的表达下降，而白介素10的表达升高，反映自血疗法对哮喘确有一定疗效。具体有的病人的治疗前后表达量改变不明显，有的是因为病人治疗前的表达即无异常，有的可能是个体的基因多态性，当然，也不排除PCR技术本身的原因。