哮喘大鼠自血肺腧穴注射治疗哮喘的实验研究

主持人：李俊雄  主任医师                
实验周期：2002.8.25～2003.8.31              
研究单位：佛山市南海中医院、广州呼吸疾病研究所、广东省中医院                      
研究人员：李俊雄、郑劲平、邓时贵
联系:nan@nanasthma.com
联 系 人：李俊雄、郑劲平、邓时贵                            
研究目的：
本实验主要研究哮喘大鼠自血肺腧穴注射对外周血IFN-γ和IL-4的影响，探讨自血肺腧穴注射对哮喘患者Th1/Th2细胞失衡的影响，为自血穴注治疗哮喘提供实验依据。

缩写与注释
IFN-γ   γ-干扰素
IL-4     白细胞介素-4
IAR      速发型哮喘
LAR      迟发性哮喘
CD4             辅助性T细胞
CD8             细胞毒性T细胞
ELISA法  酶联免疫法
EOS      嗜酸性粒细胞
BHR      气道高反应性

哮喘大鼠自血肺腧穴注射治疗哮喘的实验研究

目 录

摘  要…………………………………………………………………01
前  言…………………………………………………………………02
实验材料………………………………………………………………05
实验方法………………………………………………………………06
实验结果………………………………………………………………09
结论与讨论……………………………………………………………14
参考文献………………………………………………………………16
附  件…………………………………………………………………19

哮喘大鼠自血肺腧穴注射治疗哮喘的实验研究

【ABSTRACT】
【Objective】通过观察哮喘大鼠自血肺腧穴注射治疗后外周血IFN-γ和IL-4的变化，探讨自血肺腧穴注射对哮喘患者Th1/Th2细胞失衡的影响，为自血穴注治疗哮喘提供实验依据。
【Methods】复制卵蛋白所致哮喘大鼠实验动物模型。心脏采血，行肺腧穴注射卵蛋白哮喘大鼠自血，0.5mL血/穴，1次/天，连续治疗10天。实验期间详细记录大鼠的哮喘症状和哮喘潜伏期；末次治疗后2h，动物自心脏采血，分离血清，采用酶联免疫法（ELISA法）检测大鼠外周血清中IFN-γ、IL-4的变化，结果采用方差t检验进行组间比较。
【Results】卵蛋白所致的哮喘大鼠外周血中IFN-γ和IL-4含量较生理盐水组明显增加，提示哮喘大鼠Th1/Th2的比例失衡；肺腧穴自血注射对哮喘大鼠的哮喘症状有一定的改善作用，但效果并不十分明显；肺腧穴自血注射明显提高大鼠外周血IFN-γ的含量，促进IFN-γ的表达；而肺腧穴自血注射对哮喘大鼠外周血IL-4含量明显比哮喘模型组低，表明对IL-4的表达有抑制作用。
【Conclusion】肺腧穴自血注射对卵蛋白哮喘大鼠Th1/Th2的比例失调有纠正作用，是自血穴注射治疗哮喘的重要机理之一。
【Keywords】哮喘  穴位注射  自血  细胞因子  大鼠

哮喘大鼠自血肺腧穴注射治疗哮喘的实验研究
前  言
支气管哮喘是世界范围内最为常见的慢性呼吸道疾病, 世界各地患病率在0.10％～32％之间，我国的患病率在1％～4％之间。在过去几十年中哮喘患病率和死亡率一直逐年增高，对人类健康构成了很大的威胁。其病因病机复杂、迁延难愈、反复发作。现代研究表明，哮喘本质上是气道慢性变应性炎症反应性疾病，与免疫、变态反应等密切相关。
至今，哮喘的发病机理尚未完全阐明，对其发病机制提出了多种假说/学说，如与Ⅰ型变态反应有关的IgE学说、β肾上腺素受体学说、迷走神经学说、呼吸道炎症学说，等。在各种学说中，呼吸道炎症学说最为重要，认为哮喘的发生发展与前列腺素、白三烯、血小板活化因子等有关，该学说已得到学者的广泛认可。
近几年，对支气管哮喘发病机制的研究着重于Th1/Th2类细胞因子失衡的研究。T淋巴细胞按表面分化原的不同分为辅助性T细胞（CD4）和细胞毒性T细胞（CD8）。其中CD4细胞按分泌的细胞因子不同分为Th1和Th2细胞。Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等细胞因子，介导细胞免疫反应，主要表现在胞内病原体感染的保护和介导迟发型超敏反应。Th2细胞通过产生IL-4、IL-5、1L-10等细胞因子，主导B细胞介导的体液免疫应答及Ⅰ型变态反应。Th2的主要代表产物IL-4，能促进B细胞产生IgE，引发炎症介质释放的链式反应，促进炎症细胞的趋化聚集，引起呼吸道血管通透性增加和粘膜水肿，平滑肌痉挛及粘液分泌亢进，是引起哮喘的重要因素。Th1的主要代表产物是IFN-γ，能抑制IL-4、IL-5等细胞因子的产生，进而抑制IgE的产生和Eos活性，抑制IAR和LAR，是哮喘免疫调节中的一个重要的抑制因子，许多细胞因子通过它发挥生物效应。大量研究表明，哮喘患者的IFN-γ产生较正常对照明显减少，对IL-4和IgE的生成调节作用减弱，引起异常的免疫应答。IFN-γ也可由CD8细胞分泌。可见，IFN-γ和IL-4是一对相互拮抗的细胞因子。
穴位注射是针灸的一种，继承并发扬了针灸的优点，巧妙地将针刺的物理刺激作用、药物对机体的药理作用等有机地结合起来，起治疗作用。血液作为药用功效，最早见于明·李时珍《本草纲目》：“气味咸，平，有毒，主治羸病人皮肉干枯，身上麸片起，又狂犬咬，寒热欲发者，并刺血热饮之。”可用于治疗吐血不止、产乳血运、金疮内漏等，提示血液具有扶正祛邪补虚之功效。而血液用于治疗支气管哮喘则早在50年代前苏联就有记载。
自血穴位注射属于特殊的穴位注射，其用患者自身血液取代药物注入穴位中，产生非特异性刺激起治疗作用。
关于自血穴位注射疗法治疗哮喘近代医家做过不少尝试，疗效肯定[1、2、3、4]。实验也证实自血能提高体内皮质醇和cAMP的含量，降低嗜酸性细胞和IgE的水平，减少嗜酸细胞在气道内的浸润和改善气道重构。广东省南海市中医院为观察自血混合丙种球蛋白穴位注射对哮喘豚鼠的影响做了一系列研究[5、6、7、8、9]。结果观察到自血混合丙种球蛋白穴位注射能提高哮喘豚鼠皮质醇和cAMP、cAMP/cGMP比值,单纯自血穴注组也能提高皮质醇、cAMP和cAMP/cGMP比值 。并且注射后哮喘豚鼠肺组织β受体数目增加。光学显微镜观察哮喘豚鼠肺组织和支气管形态变化，见粘液栓基本消失,平滑肌未见明显痉挛、增厚,炎症细胞浸润大大减轻,支气管壁充血、水肿消失。电镜下肺组织内EOS基本消失,基底膜无增厚,胶原纤维无增生。
综上所述，自血穴位注射治疗哮喘临床上应用有明显疗效，并得到了实验研究结果的支持，但未见哮喘患者自血肺腧穴注射对Th1/Th2比例失调影响的相关文献报道。
本实验是在既往的研究基础上，进一步探讨哮喘大鼠自血肺腧穴注射对外周血IFN-γ和IL-4的变化，探讨自血肺腧穴注射对哮喘患者Th1/Th2细胞失衡的影响，为自血穴位注射治疗哮喘提供实验依据。
实验研究
1 实验材料
1.1实验动物
SD大鼠58只，雌雄各半，SPF级，体重：180-200g，实验动物质量合格证：粤检证字2001A051；实验动物饲养设施合格证：粤检证字第2001B025 由第一军医大学实验动物中心提供。
1.2实验设施
广东省中医院清洁级实验动物房，粤检证字：2002C002号，广东省科学技术委员会。
1.3实验试剂
大鼠IL-4 ELISA试剂盒 96人份 批号：20021025 晶美生物工程有限公司；大鼠IFN-γ ELISA试剂盒 96人份 批号：20021025 晶美生物工程有限公；卵白蛋白 100g/瓶 批号：970612上海化学试剂公司；氢氧化铝干粉 500g/瓶，批号：20020301-2 广州化学试剂厂；曲安奈德注射液（去炎松） 40mg/ml 昆明积大制药有限公司 批号：020702；0.9%氯化钠注射液  250ml/瓶，批号：0206262-3 浙江济民制药有限公司；灭活百日咳杆菌（100亿个／ml） 广州中医药大学第二临床医学院药理室提供。
1.4实验仪器
酶标仪BIO-RADS Model 550，日本；CSW--Ⅰ型超声雾化器  汕头光电研究所；10L玻璃干燥器。
2 实验方法
2.1实验分组 将动物随机分为生理盐水组（14只）、哮喘模型组（15只）、曲安奈德组（去炎松，14只）和自血穴注组（15只）。
2.2大鼠致敏  上述分组中哮喘模型组、曲安奈德组和自血穴注组每只动物腹腔注射抗原液0.5ml/100g (含卵蛋白100mg、氢氧化铝干粉100mg和2.5×109个百日咳杆菌/ml,制成悬浊液)[10]致敏第一次,次日每只大鼠再次腹腔注射0.5ml/只致敏液加强。
2.3激发和治疗 首次致敏后第15天，于每天上午8～9时大鼠置于10L玻璃干燥器内超声雾化吸入2%卵蛋白20min激发哮喘,连续14天，同时详细记录动物在激发期间的哮喘潜伏期及哮喘症状。
激发后第4天起，于每天激发后大鼠乙醚麻醉。其中哮喘模型组大鼠心脏采血1mL（弃）后，双侧肺腧穴（大鼠肺腧穴见Fig1[11]）注射生理盐水0.5mL/穴；曲安奈德组大鼠心脏采血1mL（弃）后，双侧肺腧穴注射0.225mg/穴·只曲安奈德；自血穴注组大鼠心脏采血1mL，双侧肺腧穴注射自血0.5mL/穴。
生理盐水组以生理盐水取代抗原液按0.5mL/100g腹腔注射致敏大鼠，第二天以0.5mL/只腹腔注射生理盐水加强；首次致敏后第15天，每天上午8～9时该组大鼠超声雾化吸入生理盐水20min激发哮喘,连续14天，同时详细记录动物在激发期间的哮喘潜伏期及哮喘症状。激发后第4天起，于每天激发后大鼠乙醚麻醉，心脏采血1mL（弃）后，双侧肺腧穴注射生理盐水0.5ml/穴。
2.4 外周血清中IFN-γ及IL-4的检测        
以上各组动物连续进行10次治疗，1次/天。末次治疗后2h，各组动物心脏采血5ml，1000rpm离心15min，血清分装（1mL/管）保存于－70℃低温冰箱内待测。IFN-γ、IL-4的测定采用酶联免疫法（ELISA法）：
IFN-γ的测定：
①从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条；
②除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100uL／孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60分钟；
③洗板4次；
④除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100uL／孔)。封住板孔，37℃孵育60分钟。
⑤洗板4次；
⑥除空白孔外，加入酶结合物工作液(100uL／孔)。封住板孔，37℃孵育30分钟；
⑦洗板4次；
⑧加入底物显色剂100uL／孔，37℃避光10分钟；
⑨加入终止液100uL／孔，混匀后立刻测量OD450值(5分钟内)。
IL-4的测定：
①从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条；
②除空白孔外，分别将不同浓度标准品或标本(100uL／孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟；
③洗板4次；
④除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100uL／孔)。封住板孔，37℃孵箱孵育60分钟；
⑤洗板4次；
⑥除空白孔外，加入酶结合物工作液（100uL／孔）。封住板孔，37℃孵箱孵育30分钟；
⑦洗板4次；
⑧加入显色剂100uL／孔，避光室温放置15分钟；
⑨加入终止液100ul／孔，混匀后立刻测量OD450值(5分钟内)。
结果采用方差t检验进行组间比较。

Fig1 大鼠肺腧穴解剖定位图
3 实验结果
3.1哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对血清中IL-4的影响
Tab1  哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对血清中IL-4的影响（ ±SD）
组  别        动物（只）        剂量        吸光度值（OD）
生理盐水组        8        等量生理盐水        0.048±0.007
哮喘模型组        8        等量生理盐水        0.080±0.0361
自血穴注组        10        0.5mL血/穴·d        0.050±0.0063、4
去炎松组        16        0.225mg/穴·d        0.010±0.0032、5
注：与生理盐水组比较:1p〈0.05、2p〈0.01、3p〉0.05与哮喘模型组比较:4p〈0.05、5p〈0.01
 
从Tab1、Fig1可看出，卵蛋白所致的哮喘大鼠外周血清中IL-4含量明显升高，与生理盐水组比较，差异有显著意义；而自血肺腧穴注射治疗组及去炎松治疗组大鼠外周血清中IL-4含量明显降低，其中，自血穴注射组与生理盐水组比较无显著性差异，与哮喘模型组比较差异有显著意义，而去炎松组与生理盐水组或与哮喘模型组比较差异有显著意义。
结果提示，卵蛋白所致的哮喘大鼠IL-4表达明显，外周血IL-4含量明显较生理盐水组增加；哮喘大鼠自血肺腧穴注射可明显抑制哮喘大鼠IL-4的表达，外周血IL-4含量减少；去炎松（曲安奈德）也有类似的抑制作用，但作用较自血肺腧穴注射更强。
3.2哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对血清中IFN-γ的影响
Tab2 哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对血清中IFN-γ的影响（ ±SD）
组  别        动物（只）        剂量        吸光度值（OD）
生理盐水组        8        等量生理盐水        0.116±0.014
哮喘模型组        8        等量生理盐水        0.137±0.0211
自血穴注组        10        0.5mL血/穴·d        0.173±0.0292、3
去炎松组        16        0.225mg/穴·d        0.064±0.0072、3
注：与生理盐水组比较：1p〈0.05、2p〈0.01与哮喘模型组比较：3p〈0.01
 
从Tab2、Fig2结果可以看出，卵蛋白所致的哮喘大鼠外周血清中IFN-γ含量（哮喘模型组）明显比生理盐水组大鼠外周血IFN-γ含量高，两组比较差异有显著意义；但IFN-γ含量的升高不如自血肺腧穴注射组大鼠IFN-γ含量升高明显，两者比较有明显差异。而去炎松组大鼠外周血清中IFN-γ含量明显比生理盐水组低，两者比较有显著差异。
实验结果提示，卵蛋白所致的哮喘大鼠体内IFN-γ表达较正常大鼠明显，自血肺腧穴注射则进一步促进IFN-γ的表达，外周血清中的IFN-γ含量明显比非自血干预组高，而去炎松对哮喘大鼠IFN-γ的表达不仅没有促进作用，反而表现为抑制作用。
Tab1、2 和Fig1、2结果说明，卵蛋白可引起大鼠体内IFN-γ和IL-4的明显表达，提示Th1/Th2比例失调，该结果与文献[12、13、14]报道哮喘患者Th1/Th2比例失衡相一致。卵蛋白所致的哮喘大鼠自血肺腧穴注射可进一步促进IFN-γ的表达，而对IL-4的表达表现为相反的作用即抑制作用，说明肺腧穴自血注射可以纠正卵蛋白所致的哮喘大鼠体内Th1/Th2比例失调，对哮喘的治疗有一定的指导意义。
3.3哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对哮喘症状的影响
         Tab3 哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对哮喘症状的影响
组  别        动物（只）        剂量        治疗时间        无明显哮喘症状的发生率（%）        呼吸困难症状的发生率（%）#        其它哮喘症状的发生率（%）##
生理盐水组        8        等量生理盐水        治疗前*        100        0        0
                        治疗10天**        100        0        0
哮喘模型组        8        等量生理盐水        治疗前        6.38        53.19        40.42
                        治疗10天        0.68        72.48        26.84
自血穴注组        10        0.50mL血/穴·d        治疗前        7.50        53.75        38.75
                        治疗10天        3.15        74.10        22.75
去炎松组        16        0.225mg/穴·d        治疗前        6.58        53.95        39.47
                        治疗10天        3.87        76.78        19.34
注：1 #呼吸困难症状包括：点头呼吸、张口呼吸、呼吸急促；##其它哮喘症状包括：抓鼻、烦躁、流涎
  2 治疗前：指激发后前4天累计（非治疗期间）；**治疗10天：指激发后第5～14天累计（治疗期间）
    从Tab3、Fig3可以看出，治疗前各组（除生理盐水组外）大鼠无明显哮喘症状的发生率、以及表现为呼吸困难症状的发生率和抓鼻、烦躁、流涎等其它哮喘症状的发生率未见明显差异；治疗后，自血肺腧穴注射治疗组和去炎松组大鼠无明显哮喘症状的发生率（分别为3.15%、3.87%）高于非治疗组（即哮喘模型组）的发生率（0.68%）；而表现为呼吸困难症状的发生率（分别为74.10%、76.78%）和抓鼻、烦躁、流涎等其它哮喘症状的发生率（分别为22.75%、19.34%）相当于或低于非治疗组（即哮喘模型组）的发生率（分别为72.48%、26.84%）。  
结果提示，哮喘大鼠肺腧穴自血注射对哮喘大鼠的呼吸困难、抓鼻、烦躁、流涎等哮喘症有一定的改善作用，类似的实验结果也可以从Tab4、Fig4中反映肺腧穴自血注射对哮喘大鼠哮喘症状的改善作用，但对哮喘症状的改善作用似乎不是很明显。

Tab4哮喘大鼠自血穴位（肺腧穴）注射对哮喘潜伏期的响（ ±SD）
组   别        动物（只）        剂  量        治疗时间        哮喘潜伏期（min）
生理盐水组        8        等量生理盐水        治疗前        〉20
                        治疗后5d        〉20
                        治疗后10d        〉20
哮喘模型组        8        等量生理盐水        治疗前        8.25±4.80
                        治疗后5d        4.95±3.60
                        治疗后10d        3.18±3.04
自血穴注组        10        0.5mL血/穴·d        治疗前        9.41±5.17
                        治疗后5d        5.65±5.15
                        治疗后10d        3.71±4.29
去炎松组        16        0.225mg/穴·d        治疗前        8.50±4.61
                        治疗后5d        6.64±4.70
                        治疗后10d        5.92±4.87
                                
                                
 
 
4 实验结论
Ⅰ卵蛋白所致的哮喘大鼠体内IFN-γ和IL-4表达明显增强，提示哮喘大鼠Th1/Th2的比例失衡；
Ⅱ肺腧穴自血注射对哮喘大鼠的哮喘症状如呼吸困难症状，抓鼻、烦躁、流涎等有一定的改善作用，但效果并不十分明显；
Ⅲ肺腧穴自血注射明显促进哮喘大鼠体内IFN-γ的表达，外周血IFN-γ含量升高；
Ⅳ肺腧穴自血注射对哮喘大鼠体内IL-4的表达呈现明显的抑制作用，外周血IL-4含量降低；
肺腧穴自血注射对卵蛋白哮喘大鼠Th1/Th2的比例失调有纠正作用，是自血穴注射治疗哮喘的重要机理之一。
5 讨论：
支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞和T细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。过去的研究已证实，哮喘患者Thl细胞因子正常表达或减少，而Th2细胞因子表达明显增加[14]。特异性哮喘患者BALF细胞中表达IL-5和IL-4mRNA的细胞数增多，其阳性细胞百分率与哮喘严重程度和气道高反应性(BHR)密切相关；而表达IL-2、IFN-γmRNA的细胞数无明显增加[12]。另外，哮喘加重期患者外周血中表达IL-3、IL-4\IL-5、GM-CSFmRNA的CD4+T细胞百分率较对照组增加，而表达IL-2、IFN-γmRNA的CD4+T细胞与对照组相比无显著性差异[13]。这说明哮喘患者具有明显的Thl／Th2细胞因子偏移，Th2细胞因子的产生增多在哮喘发病中具有重要的作用。
I型超敏反应关键环节在于抗原刺激机体产生过量的IgE，已知Th2细胞分泌的IL-4是B细胞唯一的IgE类别转换因子[15、16]，IL-4可以从多方面加强I型超敏反应；而Thl细胞产生的IFN-γ抑制Th2细胞增殖、活化、分泌IL-4，可以间接抑制I型超敏反应的发生[17]。目前较多学者认为过敏病人体内Thl／Th2细胞亚群失衡，Th2细胞含量升高，IL-4分泌增多，在抗原刺激下B细胞产生大量IgE，引起I型超敏反应，如何改善人体内Th1、Th2细胞失衡状态，抑制高滴度IgE产生，是当前研究方向之一[18]。
本实验发现，卵蛋白所致的哮喘大鼠体内IFN-γ和IL-4表达明显增加，提示哮喘大鼠体内Th1/Th2的比例失衡，与文献研究报道相一致；肺腧穴自血注射明显促进哮喘大鼠体内IFN-γ的表达，而对IL-4的表达有抑制作用，从而纠正卵蛋白哮喘大鼠Th1/Th2的比例失调，是自血穴注射治疗哮喘的重要机理之一。
 
参考文献
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