补肾培元胶囊治疗哮喘（缓解期）的药效学研究

摘要：为探讨补肾培元胶囊对缓解期哮喘的治疗作用，我们研究了补肾培元胶囊对免疫功能及迟发性哮喘模型的影响。结果显示：补肾培元胶囊可以提高环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠血清溶血素抗体水平（P<0.05~0.01）；增强2，4-二硝基氯苯所致免疫功能低下小鼠迟发性皮肤过敏反应程度（耳肿胀度）（P<0.05）；增强免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能（P<0.05~0.01），改善胸腺及脾脏系数（P<0.05）。并可延长迟发性哮喘豚鼠引喘潜伏期（P<0.05~0.01），升高血浆皮质醇水平（P<0.01），改善肺组织病理损害。提示补肾培元胶囊可以通过提高免疫功能，升高血清皮质醇水平对缓解期哮喘发挥治疗作用。

补肾培元胶囊由肉苁蓉、党参、冬虫夏草等组成，具有补肾培元作用，用于肾虚肺弱，久咳气喘，头目眩晕，乏力气短，腰膝酸软，畏寒肢冷之哮喘。为了解补肾培元胶囊治疗哮喘（缓解期）的药理学基础，我们研究了补肾培元胶囊对免疫功能及迟发性哮喘的影响。

实验材料
一、实验药物：
1．补肾培元胶囊：由南海市中医院提供，批号：991202。
2．金水宝胶囊：江西金水宝制药有限公司出品，批号：991204。
3．环磷酰胺片：上海天平制药厂生产，批号：950601C。
4．环磷酰胺注射液：上海华联制药有限公司生产，批号：990607。
二、实验动物：
1．NIH小鼠：购自广东省卫生厅实验动物场，合格证号：99A030。
2．豚鼠：购自第一军医大学实验动物中心。
三、实验试剂：
1．绵羊红细胞：购自广东省人民医院，批号：20000227。
2．中华墨汁：北京一得阁制。
3．白蛋白片：上海行知化工厂生产，批号：980403。
4．2，4-二硝基氯苯（DNCB）：上海试剂一厂生产，CR，批号：810901。
5．皮质醇试剂盒：北方生物技术研究所生产，批号：990425。
6．氢氧化铝：广州化学试剂厂生产，AR，批号：961201-2。
四、主要仪器设备：
1．722型光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂生产。
2．CSW-1型超生雾化器：广东汕头市光电医疗器械厂生产。
3．MP120-1型电子天平：上海第二天平仪器厂生产。
4．BECKMAN  DP5500型γ计数仪：美国BECKMAN公司生产。

实验方法
一、补肾培元胶囊对免疫功能的影响
（一） 对免疫功能低下小鼠血清溶血素抗体的影响[1-3]
取体重18~22gNIH小鼠，雌雄各半，随机分组，灌胃给药，正常对照组及模型对照组灌服等容积的蒸馏水，每日1次，共8次。除正常对照组外，其余各组从给药开始同时皮下注射环磷酰胺40mg/kg/日，连续3日；且各组于第2次药后腹腔注射5%绵羊红细胞悬液0.2ml/只，于免疫后6日，眼眶取血测溶血素。
豚鼠血清配制：取健康成年豚鼠乙醚麻醉，心前区消毒后，心脏取血，待凝固后以3000rpm离心10min，取血清于-20℃保存，临用时以生理盐水1：10稀释。
溶血素测定：眼眶取血放置1小时后，以2000rpm离心10min，取血清，用生理盐水稀释500倍后，按下表检测。

 样品管 对照管
500倍稀释血清 1ml -
生理盐水 - 1ml
绵羊红细胞稀释液 0.5ml 0.5ml
1：10豚鼠血清稀释液 1ml 1ml
然后于37℃水浴中保温10min，冰浴终止反应后2000rpm离心10min，取上清于540nm处以对照管作空白，测定各管吸收度值。
（二） 对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响[1]
取体重18~22gNIH小鼠，雌雄各半，随机分组，灌胃给药，正常对照组及模型对照组灌服等容积的蒸馏水，每日1次，共8次。除正常对照组外，其余各组从给药开始同时皮下注射环磷酰胺40mg/kg/日，连续3日；给药2天后，每鼠腹部去毛，范围约为3×3cm2，将DNCB花生油溶液50μl均匀涂抹致敏，并且于第2日强化一次。于第一次致敏后5日，将1%DNCB溶液10μl均匀涂于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24小时，颈椎胶臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用?9mm打孔器打下耳片，称重，以左右耳片重量为肿胀度进行统计学处理。
（三） 对免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏系数的影响
取体重13~15gNIH小鼠，雌雄各半，随机分组，灌胃给药，正常对照组及模型对照组灌服等容积的蒸馏水，每日1次，共8次。除正常对照组外，其余各组从给药开始同时皮下注射环磷酰胺40mg/kg/日，连续3日。于末次给药后6小时，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称重，计算脏器系数。
 
（四） 对免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（碳粒廓清法）[1]
取体重18~22gNIH小鼠，雌雄各半，随机分组，灌胃给药，正常对照组及模型对照组灌服等容积的蒸馏水，每日1次，共8次。除正常对照组外，其余各组从第2次给药后1小时开始灌服环磷酰胺溶液100mg/kg，连续2日。末次给药后1小时，于小鼠尾静脉注入稀释中华墨汁0.1ml/10g体重，于注入墨汁后30秒及6分钟从小鼠眼眶后静脉丛取血0.02ml，立刻吹入0.1%Na2CO3液2ml中，取血完毕以0.02ml正常小鼠血溶于2ml0.1%Na2CO3液校零，于分光光度计上675nm处比色，按下式计算吞噬指数K。
 
中华墨汁配制：临用时取中华墨汁用生理盐水稀释5倍即得。
二、对豚鼠迟发性哮喘的影响[4-5]
取200~300g健康豚鼠，雌雄各半，随机分组。先于大腿外侧肌肉注射4%卵蛋白生理盐水0.2ml，同时腹腔注射氢氧化铝凝胶0.2ml致敏动物。从致敏第2天起，各组动物灌胃给药，每日1次，连续11天，于给药第9天药后1小时，用2%卵蛋白生理盐水进行恒压喷雾，直至豚鼠出现喘息性抽搐为止，记录引喘潜伏期。连续引喘2次。于末次药后1小时，每只豚鼠心脏取血，用放免法测定血浆皮质醇，然后股动脉放血处死豚鼠，取支气管及肺脏，按常规作病理检查。
三、实验结果用SSPS统计软件包进行方差分析

实验结果
一、补肾培元胶囊对免疫功能的影响
（一） 对免疫功能低下小鼠血清溶血素抗体的影响
表1  对免疫功能低下小鼠溶血素抗体生成的影响（ ，n=10）
组    别 剂量g/kg OD值
正    常 - 0.220±0.089*
模    型 - 0.066±0.054
金 水 宝 1.485 0.254±0.146**
补肾培元 0.675 0.221±0.118*
 1.350 0.268±0.193**
 2.025 0.280±0.173**
注：与模型组比较，* P<0.05；** P<0.01。下同。
表1结果表明：与正常组比较，模型组血清溶血素抗体生成水平显著下降（P<0.05），说明造模成功。补肾培元胶囊低、中、高剂量组血清溶血素抗体生成水平均显著升高（P<0.05~0.01），金水宝组也有同样作用（P<0.01）。
（二） 对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响
表2  对免疫功能低下小鼠迟发性皮肤过敏反应的影响（ ，n=10）
组    别 剂量g/kg 耳肿胀度mg
正    常 - 2.20±0.92**
模    型 - 0.50±1.08
金 水 宝 1.485 1.60±0.52*
补肾培元 0.675 1.00±0.94
 1.350 1.10±0.99
 2.025 1.70±1.06*
表2结果表明：与正常组比较，模型组耳肿胀度显著减轻（P<0.01），说明造模成功。补肾培元胶囊高剂量组耳肿胀度显著升高（P<0.05），金水宝组也有同样作用（P<0.05）。补肾培元胶囊低、中剂量组虽有升高耳肿胀度的趋势，但作用不明显（P>0.05）。
（三） 对免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏系数的影响
表3  对免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏系数的影响（ ，n=10）
组    别 剂量g/kg 胸腺系数mg/10g体重 脾脏系数mg/10g体重
正    常 - 30.62±12.15** 55.30±8.15**
模    型 - 19.76±5.19 34.30±5.28
金 水 宝 1.485 29.74±2.77** 43.79±3.94*
补肾培元 0.675 19.68±8.07 37.43±7.55
 1.350 24.66±5.44 39.36±16.53
 2.025 28.54±6.82* 43.15±5.79*
表3结果表明：与正常组比较，模型组胸腺和脾脏系数均显著下降（P<0.05），说明造模成功。补肾培元胶囊高剂量能显著升高免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏系数（P<0.05），金水宝也有同样作用（P<0.05~0.01）。补肾培元低、中剂量组胸腺及脾脏系数升高不明显（P>0.05）。
（四） 对免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（碳粒廓清法）
表4  对免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（ ，n=10）
组    别 剂量g/kg 吞噬指数K
正    常 - 0.077±0.015*
模    型 - 0.033±0.014
金 水 宝 1.485 0.085±0.067**
补肾培元 0.675 0.061±0.029
 1.350 0.074±0.039*
 2.025 0.083±0.022**
表4结果表明：与正常组比较，模型组吞噬指数显著下降（P<0.05），说明造模成功。补肾培元胶囊中、高剂量组吞噬指数均显著升高（P<0.05~0.01），金水宝也有同样作用（P<0.01）。补肾培元胶囊低剂量虽有升高吞噬指数的趋势，但作用不显著（P>0.05）。
二、对豚鼠迟发性哮喘的影响
（一） 对迟发性哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响
表5  对迟发性哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响（ ，n=10）
组    别 剂量g/kg 第一次引喘min 第二次引喘min
正    常 - 8.60±1.99** 9.04±2.54*
模    型 - 3.13±1.23 6.13±2.59
金 水 宝 1.485 5.22±1.73* 8.37±2.15
补肾培元 0.675 3.93±2.02 7.68±2.21
 1.350 5.76±1.99** 9.27±2.59*

表5结果表明：与正常组比较，模型组第1、2次引喘潜伏期均显著缩短（P<0.05~0.01），说明造模成功。补肾培元胶囊高剂量组第1、2次引喘潜伏期均显著延长（P<0.05~0.01），金水宝组可显著延长第1次引喘潜伏期（P<0.05），但对第2次引喘潜伏期作用不显著（P>0.05）。补肾培元低剂量组虽有延长第1、2次引喘潜伏期的趋势，但作用不显著（P>0.05）。
（二）对迟发性哮喘豚鼠血浆皮质醇的影响
表6  对迟发性哮喘豚鼠血浆皮质醇的影响（ ）
组    别 N只 剂量g/kg 血清皮质醇ng/ml
正    常 8 - 3448.2±2210.1**
模    型 8 - 355.6±127.8
金 水 宝 9 1.485 2334.6±1608.3**
补肾培元 8 0.675 1125.7±450.9**
 8 1.350 1857.4±776.2**

表6结果表明：与正常组比较，模型组血浆皮质醇水平下降（P<0.01），说明造模成功。补肾培元低、高剂量组血浆皮质醇水平均显著提高（P<0.01），金水宝组也有同样作用（P<0.01）。
（三） 对迟发性哮喘豚鼠肺组织病理变化的影响
病理检查结果表明：正常组肺组织结构正常，肺膜菲薄，未见渗出物，沿支气管壁有淋巴组织分布，未见肺气肿改变；模型组见大叶性肺炎，支气管急性炎症，及肺气肿改变（肺泡腔扩张，肺泡壁极度变薄，呈贫血状，肺泡壁部分断裂），支气管平滑肌有不同程度不规则增厚，支气管壁见淋巴细胞、浆细胞浸润，部分支气管腔内见粘液栓；金水宝组动物肺气肿较模型组减轻，表现为中央部部分肺泡壁充血或正常状态，仅在其外围部见局部气肿，个别见粘液栓及大叶性肺炎，支气管急性炎症反应（支气管腔内见炎性渗出物，支气管壁充血、水肿、炎细胞浸润），且有一例恢复正常；补肾培元低剂量组肺气肿例数减少，程度减轻（仅见3例呈局部肺气肿，其中2例伴粘液栓出现），3例肺组织内有多量巨细胞出现，其中2例见异物肉芽肿形成，肺泡壁及肺泡腔炎细胞浸润；补肾培元高剂量组大多充血良好，未见肺气肿，支气管平滑肌增厚，淋巴细胞、浆细胞浸润。但1例见局灶炎症反应伴异物肉芽肿形成，支气管腔内见急性炎性渗出物，伴局部肺气肿。
以上述结果提示：模型组主要为肺气肿表现，补肾培元及金水宝组肺气肿有所减轻，发生肺气肿例数减少。结果详见附图。
小结
1．补肾培元胶囊有增强免疫功能作用
补肾培元胶囊能显著提高免疫功能低下小鼠血清溶血素抗体生成水平（P<0.05~0.01）；增强免疫功能低下小鼠迟发性皮肤过敏反应程度（P<0.05）；增加免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏系数（P<0.05）；增加免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬指数（P<0.05~0.01）。以上结果表明补肾培元胶囊具有增强免疫功能的作用。
2．补肾培元胶囊有抑制迟发性哮喘作用
补肾培元胶囊能显著延长迟发性哮喘豚鼠引喘潜伏期（P<0.05~0.01），提高血浆皮质醇水平（P<0.05~0.01），改善迟发性哮喘豚鼠肺组织病理损害。表明补肾培元胶囊有抑制迟发性哮喘作用。
综上所述，补肾培元胶囊可以通过增强免疫功能，提高血浆皮质醇水平，改善病理损害来防治哮喘的发生与发展，为补肾培元胶囊临床用于治疗哮喘提供药理学依据。

参考文献：
1．陈奇主编，中药药理研究方法学，第一版，北京：人民卫生出版社，1993，750、747、757
2．徐淑云，卞如濂，陈修主编，药理实验方法学，第二版，北京：人民卫生出版社，1991，1231
3．张均田主编，现代药理实验方法（上册），第一版，北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，1998，738
4．Huston PA,Varlry JG. Sanjar S et al. Evidence that neutrophils do not participate in the late -phase airway response provoked by ova-albumin inhalation in conscious sensitized guinea-pigs.Am Res Resptis Dis  1990，141：535
5．郭鹞，人类疾病的动物模型，第1辑，北京：人民卫生出版社，1982，246~248

实验负责人：吴清和  副研究员  硕士  中药药理教研室主任
实验参加人员：荣向路  讲师  硕士
韩  坚  技师
操红缨  硕士研究生
徐海波  硕士研究生
实验完成时间：1999年12月~2000年5月
原始资料保存：广州中医药大学中药药理教研室
联   系   人：荣向路  （020）86591233-2743

广州中医药大学中药药理教研室
2000年7月25日

附图1  正常  ×100  示细支气管及周围肺泡均正常

附图2  正常  ×400示细支气管上皮完整，腔内未见渗出物。

附图3  模型  ×100  肺气肿，一支气管平滑肌不规则增厚

附图4  模型  ×100  示肺泡扩张，肺泡壁变薄呈贫血状，
部分肺泡壁断裂（肺气肿）

附图5  模型  ×100  肺气肿，小支气管内粘液栓

附图6  模型  ×400  细支气管上皮脱落，基底膜纤维增生，增厚

附图7  金水宝  ×100  基本正常

附图8  金水宝  ×100  轻度气肿，细支气管平滑肌增厚

附图9  补肾培元低  ×100  异物肉芽肿，肺组织炎症反应

附图10  补肾培元低  ×100  结构正常，无明显病变。

附图11  补肾培元高  ×100  细支气管平滑肌未见明显增厚，未见肺气肿。

附图12  补肾培元高  ×400  细支气管平滑肌增厚不明显